แลคเคส (Laccase )
แลคเคสได้รับความสนใจมากจากนักวิจัยในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา เนื่องจากแลคเคสเป็นเอนไซม์ในกลุ่มออกซิโดรีดักเดส (Oxidoreductase) ที่สามารถเกิดปฏิกิริยา โดยให้อิเล็กตรอนและมีโมเลกุลออกซิเจนเป็นตัวรับอิเล็กตรอน (Malmstrom, 1982) จึงมีการเรียกชื่อเอนไซม์แลคเคสตามชื่อแบบระบบ (Systematic name) ว่า EC 1.10.3.2 หมายความว่า เอนไซม์ที่อยู่ในกลุ่มเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันรีดักชัน โดยมีการย้ายอิเล็กตรอนจากโมเลกุลหนึ่งไปยังโมเลกุลหนึ่งและเป็นเอนไซม์ที่มีโมเลกุลของโลหะคอปเปอร์ (Cu+2) เป็นองค์ประกอบภายในโครงสร้างโมเลกุลด้วย (Dooley, 1999) เอนไซม์แลคเคสจะเข้าไปเป็นตัวคะตะไลส์หรือเป็นตัวเร่งในปฏิกิริยาและมีความสามารถในการใช้สับสเตรทได้หลากหลายชนิด เช่น polyphenol, aromatic, benzinethiols, anthraquinone, syringalazine, 2,6 dimethoxyphenol, veratryl alcohol, 2,5 xylidiene, ferulic acid และยังมีสับสเตรทที่เป็นพวก non-phenolic compounds เช่น HAA, HPI, VLA และABTS เป็นต้น (Bourbonnais และคณะ, 1990)
O 2 - + 2H + → H 2 O
ในปี 1883 มีผู้ค้นพบเอนไซม์แลคเคสเป็นครั้งแรกจากต้นไม้ชื่อ Lacquer (Rhus vernicifera) ในประเทศญี่ปุ่น (Yoshida, 1883) ต่อมาในปี 1998 มีผู้ค้นพบเอนไซม์แลคเคสในเชื้อราจำพวกไวท์รอทหลายชนิด, แบคทีเรีย, พืชชั้นสูงและแมลงบางชนิด (Frederic และคณะ, 1998) แต่ส่วนมากจะพบในกลุ่มเชื้อราเป็นส่วนใหญ่ เช่น Trametes versicolor (Gonzaloและคณะ, 2003), Pleurotus strain 32 (Hougmam และคณะ, 2004), Pycnoporus cinnabarinus (Juan และคณะ, 2005), Trametes hirsute (Susana และคณะ, 2005), Monotospora sp. (Wang และคณะ, 2006), Phanerochaete chrysosporium NCIM 1197 (Gnanamani และคณะ, 2006) และพบในแบคทีเรียที่มีสปอร์ห่อหุ้มด้วยโปรตีน cotA จากรายงานพบใน Bacillus subtilis (Enguita, 2003)
โครงสร้างผลึกของแลคเคส (Crystal structure of laccase)
ความหมายของโครงสร้างผลึก
โครงสร้างผลึก (Crystal structure) คือ การจัดเรียงกันของอะตอมเป็นการเฉพาะตัวในผลึก โครงสร้างผลึกประกอบด้วย หน่วยเซลล์ (Unit cell) ซึ่งเป็นกลุ่มของอะตอมที่จัดเรียงกันในทางเฉพาะเป็นโครงสร้างสามมิติ รูปผลึก (Crystal form) เกิดจากการจับกันหรือจัดเรียงตัวกันอย่างเป็นระเบียบของอะตอมในโครงสร้างภายในและปรากฏเป็นรูปผลึกมีหน้าผลึกด้านต่างๆ ประกอบกันขึ้นมาเป็นรูปทรงเรขาคณิตแตกต่างกัน ซึ่งสามารถจัดแบ่งออกได้รูปแบบผลึกโดยพิจารณาจากองค์ประกอบต่างๆ ของผลึก (Http://www.eng.mut.ac.th/upload_file/article/391.ppt)
ลักษณะโครงสร้างผลึกของแลคเคส
การศึกษาโครงสร้างผลึกของแลคเคส (Laccase) ใช้ความละเอียดขนาด (Resolution) 1.5 Aº ใช้เทคนิคการแทนที่ของโมเลกุล โดยใช้รูปต้นแบบของแลคเคสจากเชื้อ Coprinus cinereus (pdb code : 1HFU) ซึ่งมีลักษณะโครงสร้างโปรตีนแบบพับขดงอและเป็นโปรตีนก้อนที่รวมกับน้ำตาล เรียกว่า ไกลโคโปรตีน (Glycoprotein) ที่มีขนาด 70 × 60 × 50 Aº โครงสร้างโมเลกุลที่มีการจัดเรียงโดเมน (Cupredoxin-like domains) ในแต่ละโดเมนมีการต่อแบบ greek key β-barrel กับอะตอมของคอปเปอร์ 3 กลุ่ม (ภาพที่ 1) โดยโดเมนที่ 1 อยู่ในช่วง 1-141 , โดเมนที่ 2 อยู่ในช่วง 142-303 และโดเมนที่ 3 อยู่ในช่วง 304-498 โครงสร้างโมเลกุลของแลคเคสมีความแข็งแรงและเสถียรมาก เนื่องจากการสร้างพันธะไฮโดรเจนซัลไฟด์ระหว่าง Cys85 กับ Cys485 ของโดเมนที่ 1 และ 3 ตามลำดับ และระหว่าง Cys117 กับ Cys204 ในโดเมนที่ 1 และ 2 แสดงโครงสร้างแลคเคสที่คล้ายกับแลคเคสในกลุ่มเชื้อรา Basidiomyceteous และ Trametes versicolor (Hakulinen และคณะ, 2002)
ตำแหน่งที่เกิด N-glycosylation ประกอบด้วย 3-10 ตำแหน่ง มีการเกิด Glycosilaytion 5 พันธะ ที่เชื่อมต่อด้วย α-linked ที่ Asn โดย N-acetylglucosamime 2โมเลกุล และเชื่อมต่อด้วย β-linked จับกับ Asn โดย N-acetylglucosamime 3โมเลกุล (Ryde และคณะ, 2007)
ภาพที่ 1 แสดงโครงสร้างผลึกของ Trametes versicolor ประกอบด้วย 3 โดเมนที่จับกับกลุ่มคอปเปอร์ 3 กลุ่ม โดยโดเมนที่ 1 (สีน้ำเงิน) โดเมนที่ 2 (สีเขียว) และโดเมนที่ 3 (สีส้ม) มีสับสเตรท ABTS จับบริเวณ Mononuclear และมีพันธะไฮโดรเจนซัลไฟด์ (สีเหลือง) เกิดขึ้นด้วย
กลุ่มคอปเปอร์ภายในโครงสร้างของแลคเคส (Copper type in structure of laccase)
กลุ่มคอปเปอร์ที่เป็นองค์ประกอบภายในโครงสร้างโมเลกุลของแลคเคสมี 3 กลุ่ม (Dooley, 1999) คือ
1. กลุ่มคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper)
เป็นคอปเปอร์สีน้ำเงินที่มีอะตอมของคอปเปอร์อยู่แบบเดียวๆ มีความสามารถในการ Absorbance อิเล็กตรอนที่ 610 นาโนเมตร
2. กลุ่มคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper)
เป็นคอปเปอร์ที่ไม่มีการ Absorbance อิเล็กตรอน แต่จะมีการสร้าง EPR ซึ่งเป็นสัญญาณของโปรตีนจะทำงานร่วมกับคอปเปอร์ T3
3. กลุ่มคอปเปอร์ T3 (type-3-copper)
เป็นคอปเปอร์ที่มีอะตอมอยู่กันเป็นคู่หมุนกับคู่ของคอปเปอร์ จะมีการ Absorbance อิเล็กตรอนที่ 330 นาโมเมตร
มีการค้นพบว่าแลคเคสมีลักษณะเป็นโครงสร้างผลึกครั้งแรกจากเชื้อ Coprinus cinereus ประกอบด้วยกลุ่มคอปเปอร์ 3 กลุ่มอย่างละ 1 โมเลกุลจัดเรียงกันเป็น 2 มิติกับโดเมน 3 โดเมน (Ducros และคณะ, 1998) แต่ปัจจุบันพบว่าแลคเคสมีโครงสร้างโมเลกุลเป็น 3 มิติประกอบด้วย 1 โมเลกุลของคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) กับคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper) และ 2 โมเลกุลของคอปเปอร์ T3 (Type-3-copper) (Gonzaloและคณะ, 2003)
บริเวณที่จับกับสับสเตรทของแลคเคส (Substrate binding sites of laccase)
โครงสร้างผลึกของแลคเคสไม่แสดงลักษณะเฉพาะของตำแหน่งที่เร่งปฏิกิริยา(Active site) แต่มีการรีดิวซ์สับสเตรทและถ่ายโอนอิเล็กตรอนไปยังคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ซึ่งอยู่ในโดเมนที่ 3 บริเวณที่จับกับสับสเตรทของแลคเคสเป็นบริเวณที่มีขนาดใหญ่อยู่ใกล้บริเวณคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ซึ่งกรดอะมิโนส่วนใหญ่เป็น Histidine (His) และเป็นลิแกนของคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ล้อมรอบด้วยกรดอะมิโนที่เกี่ยวข้องกับการจับของสับสเตรทต่างๆ จึงทำให้แลคเคสมีสมบัติความจำเพาะเจาะจงกับสับสเตรทได้หลากหลายชนิด ส่วนบริเวณที่ไม่ชอบน้ำจะเป็นกรดอะมิโนชนิด Phe อาจพบร่วมกับกรดอะมิโนที่ชอบน้ำ เช่น Asp, Lys, Tyr และ Prolines ตำแหน่งที่มี Pro ซึ่งความหลากหลายของชนิดกรดอะมิโนนี้สามารถอธิบายได้ถึงศักยภาพการรีดิวซ์ (Redox potential) ของโมเลกุลคอปเปอร์ T 1 (Type-1-copper) ( > 700 mV ) ซึ่งเปรียบเทียบได้กับแลคเคสที่พบใน Trametes versicolor (Hakulinen และคณะ, 2002)
ภาพที่ 2 แสดงบริเวณที่จับกับสับสเตรท (Substrate binding sites) ภายในโครงสร้างผลึกของ Trametes versicolor
บริเวณที่ใช้งานภายในโครงสร้างผลึกของแลคเคส (Active sites of laccase)
1. บริเวณที่ใช้งานของกลุ่มคอปเปอร์ T1 (Mononuclear site)
บริเวณที่ใช้งานครั้งแรกพบว่าอยู่ใกล้กับผิวภายนอกโมเลกุลและเป็นบริเวณที่จับกับสับสเตรทที่เป็นสารอินทรีย์ ส่วนใหญ่เป็นกลุ่มฟีนอล (Phenols) หรือกลุ่มอัลลาไมด์ (Arylamines) จะออกซิไดส์อิเล็กตรอนแล้วปล่อยอิเล็กตรอนไป โดยผ่านกลุ่มคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ส่วนที่จับกับ His และ Cys ทั้งหมด (ภาพที่ 3A) เป็นส่วนของโดเมนที่ 3 และจะส่งเข้าไปยังบริเวณ Trinuclear (T2/T3) (Solomon และคณะ, 2001)
2. บริเวณที่ใช้งานของกลุ่มคอปเปอร์ T2/T3 (Trinuclear site)
เมื่ออิเล็กตรอนถูกส่งเข้ามาบริเวณ Trinuclear (T2/T3) อิเล็กตรอนจะถูกถ่ายโอนผ่านช่องทาง 2 ช่องทางภายในโครงสร้างโมเลกุลของแลคเคส (Intramolecular) (Morgunova และคณะ, 2006) อิเล็กตรอนจะถูกถ่ายโอนผ่านบริเวณที่มี Cys และHis 2 ตัวของคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ไปยังบริเวณที่ใช้งานบริเวณที่ 2 คือ บริเวณ Trinuclear (T2/T3) บริเวณนี้จะจับและรีดิวซ์โมเลกุลของออกซิเจนได้น้ำเกิดขึ้น ซึ่งบริเวณ Trinuclear จะประกอบด้วย 1 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper) และ 2 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T3 (Type-3-copper) จัดอยู่ในลักษณะรูปสามเหลี่ยมอยู่ระหว่างโดเมนที่ 1 กับ โดเมนที่ 3 จับกับ His 8 ตัวและ 2 โมเลกุลของน้ำ ส่วนกลุ่มคอปเปอร์ T2 มีลักษณะเป็นไตรโคออดิเนส (Tricoordinated) จับกับ His 2 ตัวและ 1 โมเลกุลของน้ำ 2 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T3(a) เป็นบริเวณที่จับกับสาร His111, His399 และ His449 ส่วน T3(b) เป็นบริเวณที่จับกับสาร His66, His109 และ His451 นอกจากนี้ยังมีการจับกับโมเลกุลของน้ำแบบไม่สมมาตร (Asymmetrically) กับ 2 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T3 (T3 (a) ระยะทาง 2.98 Å และ T3 (b) มีระยะทางเท่ากับ 2.23 Å) (ภาพที่ 3B) พื้นผิวของตัวทำละลายมี 2 ช่องทางในการถ่ายโอนอิเล็กตรอนให้เข้าไปยังบริเวณ Trinuclear (T2/T3) ภายในโครงสร้างโมเลกุลของแลคเคส ซึ่งช่องทางแรกเป็น 2 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T3 (Type-3-copper) ด้านหนึ่งของกลุ่ม T2/T3 ช่องทางนี้จะยอมจับกับโมเลกุลของออกซิเจน ส่วนช่องทางที่ 2 เป็นโมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper) จะรีดิวซ์โมเลกุลของออกซิเจนได้น้ำเกิดขึ้นและน้ำจะเคลื่อนที่ไปผสมกับตัวทำละลายต่อไป (Lee และคณะ, 2002)
ภาพที่ 3 (A) แสดงบริเวณที่ใช้งานของกลุ่มคอปเปอร์ T1 (Mononuclear site) และ (B) แสดงบริเวณที่ใช้งานของกลุ่มทองแดง T2/T3 (Trinuclear site)
ปฏิกิริยาของแลคเคส (Reaction of laccase)
แลคเคสจะทำปฏิกิริยาออกซิเดชันรีดักชันกับอิเล็กตรอนของสับสเตรทบริเวณ Mononuclear (Type-1-copper) แล้วอิเล็กตรอนจะถูกถ่ายโอนผ่าน His-Cys-His ซึ่งเป็นบริเวณ Trinuclear (Type-2-copper/Type-3-copper) บริเวณนี้จะทำหน้าที่รีดิวซ์โมเลกุลของออกซิเจนได้น้ำเกิดขึ้นและจะส่งออกภายนอกต่อไป โดยอิเล็กตรอนจะถูกถ่ายโอนผ่านช่องทางสำหรับการถ่ายโอนอิเล็กตรอนอยู่ 2 ช่องทาง ซึ่งเป็นบริเวณ Trinuclear (T2/T3) ช่องทางแรกเป็นโมเลกุลของคอปเปอร์ T3 (Type-3-copper) ช่องทางนี้จะจับกับโมเลกุลของออกซิเจน ส่วนช่องทางที่ 2 เป็นโมเลกุลของคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper) ช่องนี้จะทำการรีดิวซ์โมเลกุลของออกซิเจนได้น้ำเกิดขึ้น (ภาพที่ 4 ) และน้ำจะเคลื่อนที่ไปผสมกับตัวทำละลายต่อไป (Rulisek และคณะ, 2005)
ภาพที่ 4 แสดงวัฎจักรปฎิกิริยาของแลคเคส
แลคเคสได้รับความสนใจมากจากนักวิจัยในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา เนื่องจากแลคเคสเป็นเอนไซม์ในกลุ่มออกซิโดรีดักเดส (Oxidoreductase) ที่สามารถเกิดปฏิกิริยา โดยให้อิเล็กตรอนและมีโมเลกุลออกซิเจนเป็นตัวรับอิเล็กตรอน (Malmstrom, 1982) จึงมีการเรียกชื่อเอนไซม์แลคเคสตามชื่อแบบระบบ (Systematic name) ว่า EC 1.10.3.2 หมายความว่า เอนไซม์ที่อยู่ในกลุ่มเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันรีดักชัน โดยมีการย้ายอิเล็กตรอนจากโมเลกุลหนึ่งไปยังโมเลกุลหนึ่งและเป็นเอนไซม์ที่มีโมเลกุลของโลหะคอปเปอร์ (Cu+2) เป็นองค์ประกอบภายในโครงสร้างโมเลกุลด้วย (Dooley, 1999) เอนไซม์แลคเคสจะเข้าไปเป็นตัวคะตะไลส์หรือเป็นตัวเร่งในปฏิกิริยาและมีความสามารถในการใช้สับสเตรทได้หลากหลายชนิด เช่น polyphenol, aromatic, benzinethiols, anthraquinone, syringalazine, 2,6 dimethoxyphenol, veratryl alcohol, 2,5 xylidiene, ferulic acid และยังมีสับสเตรทที่เป็นพวก non-phenolic compounds เช่น HAA, HPI, VLA และABTS เป็นต้น (Bourbonnais และคณะ, 1990)
O 2 - + 2H + → H 2 O
ในปี 1883 มีผู้ค้นพบเอนไซม์แลคเคสเป็นครั้งแรกจากต้นไม้ชื่อ Lacquer (Rhus vernicifera) ในประเทศญี่ปุ่น (Yoshida, 1883) ต่อมาในปี 1998 มีผู้ค้นพบเอนไซม์แลคเคสในเชื้อราจำพวกไวท์รอทหลายชนิด, แบคทีเรีย, พืชชั้นสูงและแมลงบางชนิด (Frederic และคณะ, 1998) แต่ส่วนมากจะพบในกลุ่มเชื้อราเป็นส่วนใหญ่ เช่น Trametes versicolor (Gonzaloและคณะ, 2003), Pleurotus strain 32 (Hougmam และคณะ, 2004), Pycnoporus cinnabarinus (Juan และคณะ, 2005), Trametes hirsute (Susana และคณะ, 2005), Monotospora sp. (Wang และคณะ, 2006), Phanerochaete chrysosporium NCIM 1197 (Gnanamani และคณะ, 2006) และพบในแบคทีเรียที่มีสปอร์ห่อหุ้มด้วยโปรตีน cotA จากรายงานพบใน Bacillus subtilis (Enguita, 2003)
โครงสร้างผลึกของแลคเคส (Crystal structure of laccase)
ความหมายของโครงสร้างผลึก
โครงสร้างผลึก (Crystal structure) คือ การจัดเรียงกันของอะตอมเป็นการเฉพาะตัวในผลึก โครงสร้างผลึกประกอบด้วย หน่วยเซลล์ (Unit cell) ซึ่งเป็นกลุ่มของอะตอมที่จัดเรียงกันในทางเฉพาะเป็นโครงสร้างสามมิติ รูปผลึก (Crystal form) เกิดจากการจับกันหรือจัดเรียงตัวกันอย่างเป็นระเบียบของอะตอมในโครงสร้างภายในและปรากฏเป็นรูปผลึกมีหน้าผลึกด้านต่างๆ ประกอบกันขึ้นมาเป็นรูปทรงเรขาคณิตแตกต่างกัน ซึ่งสามารถจัดแบ่งออกได้รูปแบบผลึกโดยพิจารณาจากองค์ประกอบต่างๆ ของผลึก (Http://www.eng.mut.ac.th/upload_file/article/391.ppt)
ลักษณะโครงสร้างผลึกของแลคเคส
การศึกษาโครงสร้างผลึกของแลคเคส (Laccase) ใช้ความละเอียดขนาด (Resolution) 1.5 Aº ใช้เทคนิคการแทนที่ของโมเลกุล โดยใช้รูปต้นแบบของแลคเคสจากเชื้อ Coprinus cinereus (pdb code : 1HFU) ซึ่งมีลักษณะโครงสร้างโปรตีนแบบพับขดงอและเป็นโปรตีนก้อนที่รวมกับน้ำตาล เรียกว่า ไกลโคโปรตีน (Glycoprotein) ที่มีขนาด 70 × 60 × 50 Aº โครงสร้างโมเลกุลที่มีการจัดเรียงโดเมน (Cupredoxin-like domains) ในแต่ละโดเมนมีการต่อแบบ greek key β-barrel กับอะตอมของคอปเปอร์ 3 กลุ่ม (ภาพที่ 1) โดยโดเมนที่ 1 อยู่ในช่วง 1-141 , โดเมนที่ 2 อยู่ในช่วง 142-303 และโดเมนที่ 3 อยู่ในช่วง 304-498 โครงสร้างโมเลกุลของแลคเคสมีความแข็งแรงและเสถียรมาก เนื่องจากการสร้างพันธะไฮโดรเจนซัลไฟด์ระหว่าง Cys85 กับ Cys485 ของโดเมนที่ 1 และ 3 ตามลำดับ และระหว่าง Cys117 กับ Cys204 ในโดเมนที่ 1 และ 2 แสดงโครงสร้างแลคเคสที่คล้ายกับแลคเคสในกลุ่มเชื้อรา Basidiomyceteous และ Trametes versicolor (Hakulinen และคณะ, 2002)
ตำแหน่งที่เกิด N-glycosylation ประกอบด้วย 3-10 ตำแหน่ง มีการเกิด Glycosilaytion 5 พันธะ ที่เชื่อมต่อด้วย α-linked ที่ Asn โดย N-acetylglucosamime 2โมเลกุล และเชื่อมต่อด้วย β-linked จับกับ Asn โดย N-acetylglucosamime 3โมเลกุล (Ryde และคณะ, 2007)
ภาพที่ 1 แสดงโครงสร้างผลึกของ Trametes versicolor ประกอบด้วย 3 โดเมนที่จับกับกลุ่มคอปเปอร์ 3 กลุ่ม โดยโดเมนที่ 1 (สีน้ำเงิน) โดเมนที่ 2 (สีเขียว) และโดเมนที่ 3 (สีส้ม) มีสับสเตรท ABTS จับบริเวณ Mononuclear และมีพันธะไฮโดรเจนซัลไฟด์ (สีเหลือง) เกิดขึ้นด้วย
กลุ่มคอปเปอร์ภายในโครงสร้างของแลคเคส (Copper type in structure of laccase)
กลุ่มคอปเปอร์ที่เป็นองค์ประกอบภายในโครงสร้างโมเลกุลของแลคเคสมี 3 กลุ่ม (Dooley, 1999) คือ
1. กลุ่มคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper)
เป็นคอปเปอร์สีน้ำเงินที่มีอะตอมของคอปเปอร์อยู่แบบเดียวๆ มีความสามารถในการ Absorbance อิเล็กตรอนที่ 610 นาโนเมตร
2. กลุ่มคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper)
เป็นคอปเปอร์ที่ไม่มีการ Absorbance อิเล็กตรอน แต่จะมีการสร้าง EPR ซึ่งเป็นสัญญาณของโปรตีนจะทำงานร่วมกับคอปเปอร์ T3
3. กลุ่มคอปเปอร์ T3 (type-3-copper)
เป็นคอปเปอร์ที่มีอะตอมอยู่กันเป็นคู่หมุนกับคู่ของคอปเปอร์ จะมีการ Absorbance อิเล็กตรอนที่ 330 นาโมเมตร
มีการค้นพบว่าแลคเคสมีลักษณะเป็นโครงสร้างผลึกครั้งแรกจากเชื้อ Coprinus cinereus ประกอบด้วยกลุ่มคอปเปอร์ 3 กลุ่มอย่างละ 1 โมเลกุลจัดเรียงกันเป็น 2 มิติกับโดเมน 3 โดเมน (Ducros และคณะ, 1998) แต่ปัจจุบันพบว่าแลคเคสมีโครงสร้างโมเลกุลเป็น 3 มิติประกอบด้วย 1 โมเลกุลของคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) กับคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper) และ 2 โมเลกุลของคอปเปอร์ T3 (Type-3-copper) (Gonzaloและคณะ, 2003)
บริเวณที่จับกับสับสเตรทของแลคเคส (Substrate binding sites of laccase)
โครงสร้างผลึกของแลคเคสไม่แสดงลักษณะเฉพาะของตำแหน่งที่เร่งปฏิกิริยา(Active site) แต่มีการรีดิวซ์สับสเตรทและถ่ายโอนอิเล็กตรอนไปยังคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ซึ่งอยู่ในโดเมนที่ 3 บริเวณที่จับกับสับสเตรทของแลคเคสเป็นบริเวณที่มีขนาดใหญ่อยู่ใกล้บริเวณคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ซึ่งกรดอะมิโนส่วนใหญ่เป็น Histidine (His) และเป็นลิแกนของคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ล้อมรอบด้วยกรดอะมิโนที่เกี่ยวข้องกับการจับของสับสเตรทต่างๆ จึงทำให้แลคเคสมีสมบัติความจำเพาะเจาะจงกับสับสเตรทได้หลากหลายชนิด ส่วนบริเวณที่ไม่ชอบน้ำจะเป็นกรดอะมิโนชนิด Phe อาจพบร่วมกับกรดอะมิโนที่ชอบน้ำ เช่น Asp, Lys, Tyr และ Prolines ตำแหน่งที่มี Pro ซึ่งความหลากหลายของชนิดกรดอะมิโนนี้สามารถอธิบายได้ถึงศักยภาพการรีดิวซ์ (Redox potential) ของโมเลกุลคอปเปอร์ T 1 (Type-1-copper) ( > 700 mV ) ซึ่งเปรียบเทียบได้กับแลคเคสที่พบใน Trametes versicolor (Hakulinen และคณะ, 2002)
ภาพที่ 2 แสดงบริเวณที่จับกับสับสเตรท (Substrate binding sites) ภายในโครงสร้างผลึกของ Trametes versicolor
บริเวณที่ใช้งานภายในโครงสร้างผลึกของแลคเคส (Active sites of laccase)
1. บริเวณที่ใช้งานของกลุ่มคอปเปอร์ T1 (Mononuclear site)
บริเวณที่ใช้งานครั้งแรกพบว่าอยู่ใกล้กับผิวภายนอกโมเลกุลและเป็นบริเวณที่จับกับสับสเตรทที่เป็นสารอินทรีย์ ส่วนใหญ่เป็นกลุ่มฟีนอล (Phenols) หรือกลุ่มอัลลาไมด์ (Arylamines) จะออกซิไดส์อิเล็กตรอนแล้วปล่อยอิเล็กตรอนไป โดยผ่านกลุ่มคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ส่วนที่จับกับ His และ Cys ทั้งหมด (ภาพที่ 3A) เป็นส่วนของโดเมนที่ 3 และจะส่งเข้าไปยังบริเวณ Trinuclear (T2/T3) (Solomon และคณะ, 2001)
2. บริเวณที่ใช้งานของกลุ่มคอปเปอร์ T2/T3 (Trinuclear site)
เมื่ออิเล็กตรอนถูกส่งเข้ามาบริเวณ Trinuclear (T2/T3) อิเล็กตรอนจะถูกถ่ายโอนผ่านช่องทาง 2 ช่องทางภายในโครงสร้างโมเลกุลของแลคเคส (Intramolecular) (Morgunova และคณะ, 2006) อิเล็กตรอนจะถูกถ่ายโอนผ่านบริเวณที่มี Cys และHis 2 ตัวของคอปเปอร์ T1 (Type-1-copper) ไปยังบริเวณที่ใช้งานบริเวณที่ 2 คือ บริเวณ Trinuclear (T2/T3) บริเวณนี้จะจับและรีดิวซ์โมเลกุลของออกซิเจนได้น้ำเกิดขึ้น ซึ่งบริเวณ Trinuclear จะประกอบด้วย 1 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper) และ 2 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T3 (Type-3-copper) จัดอยู่ในลักษณะรูปสามเหลี่ยมอยู่ระหว่างโดเมนที่ 1 กับ โดเมนที่ 3 จับกับ His 8 ตัวและ 2 โมเลกุลของน้ำ ส่วนกลุ่มคอปเปอร์ T2 มีลักษณะเป็นไตรโคออดิเนส (Tricoordinated) จับกับ His 2 ตัวและ 1 โมเลกุลของน้ำ 2 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T3(a) เป็นบริเวณที่จับกับสาร His111, His399 และ His449 ส่วน T3(b) เป็นบริเวณที่จับกับสาร His66, His109 และ His451 นอกจากนี้ยังมีการจับกับโมเลกุลของน้ำแบบไม่สมมาตร (Asymmetrically) กับ 2 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T3 (T3 (a) ระยะทาง 2.98 Å และ T3 (b) มีระยะทางเท่ากับ 2.23 Å) (ภาพที่ 3B) พื้นผิวของตัวทำละลายมี 2 ช่องทางในการถ่ายโอนอิเล็กตรอนให้เข้าไปยังบริเวณ Trinuclear (T2/T3) ภายในโครงสร้างโมเลกุลของแลคเคส ซึ่งช่องทางแรกเป็น 2 โมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T3 (Type-3-copper) ด้านหนึ่งของกลุ่ม T2/T3 ช่องทางนี้จะยอมจับกับโมเลกุลของออกซิเจน ส่วนช่องทางที่ 2 เป็นโมเลกุลของกลุ่มคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper) จะรีดิวซ์โมเลกุลของออกซิเจนได้น้ำเกิดขึ้นและน้ำจะเคลื่อนที่ไปผสมกับตัวทำละลายต่อไป (Lee และคณะ, 2002)
ภาพที่ 3 (A) แสดงบริเวณที่ใช้งานของกลุ่มคอปเปอร์ T1 (Mononuclear site) และ (B) แสดงบริเวณที่ใช้งานของกลุ่มทองแดง T2/T3 (Trinuclear site)
ปฏิกิริยาของแลคเคส (Reaction of laccase)
แลคเคสจะทำปฏิกิริยาออกซิเดชันรีดักชันกับอิเล็กตรอนของสับสเตรทบริเวณ Mononuclear (Type-1-copper) แล้วอิเล็กตรอนจะถูกถ่ายโอนผ่าน His-Cys-His ซึ่งเป็นบริเวณ Trinuclear (Type-2-copper/Type-3-copper) บริเวณนี้จะทำหน้าที่รีดิวซ์โมเลกุลของออกซิเจนได้น้ำเกิดขึ้นและจะส่งออกภายนอกต่อไป โดยอิเล็กตรอนจะถูกถ่ายโอนผ่านช่องทางสำหรับการถ่ายโอนอิเล็กตรอนอยู่ 2 ช่องทาง ซึ่งเป็นบริเวณ Trinuclear (T2/T3) ช่องทางแรกเป็นโมเลกุลของคอปเปอร์ T3 (Type-3-copper) ช่องทางนี้จะจับกับโมเลกุลของออกซิเจน ส่วนช่องทางที่ 2 เป็นโมเลกุลของคอปเปอร์ T2 (Type-2-copper) ช่องนี้จะทำการรีดิวซ์โมเลกุลของออกซิเจนได้น้ำเกิดขึ้น (ภาพที่ 4 ) และน้ำจะเคลื่อนที่ไปผสมกับตัวทำละลายต่อไป (Rulisek และคณะ, 2005)
ภาพที่ 4 แสดงวัฎจักรปฎิกิริยาของแลคเคส
ความคิดเห็นนี้ถูกผู้เขียนลบ
ตอบลบเป็นบทความที่เป็นประโยชน์จิงๆ
ตอบลบLaccase is a blue copper oxidase that reduces molecular oxygen to water. Laccase oxidizes polyphenols, methoxy-substituted phenols and diamines, but not tyrosine. laccase
ตอบลบอยากได้รูปภาพอะคะ กดที่ลิงค์ไม่ติดเลย พอดีสนใจเรื่องเเลคเคสค่ะ
ตอบลบ